Analisi in vivo del rilascio di bisfenolo A da un sigillante

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Fig. 1 Risultati ottenuti nei 15 campioni-test riportati in forma di grafico
Fig. 2 Grafico con i valori medi e le relative deviazioni standard delle concentrazioni di BPA in soggetti: di sesso maschile, di sesso femminile, fumatori e non fumatori. I valori sono stati comparati con il valore medio dei 15 campioni-test

Introduzione

Il bisfenolo A (BPA) à, per definizione, uno dei componenti principali del bis-GMA (bisfenolo A-glicidilmetacrilato o resina di Bowen), molecola che e alla base della maggior parte dei compositi e sigillanti in commercio. Benché fosse noto da tempo che alcuni composti difenilici, contenenti due gruppi idrossilici in posizione para, possano manifestare attivitaà estrogenica, eà solo a partire dalla metaà degli anni Novanta che la ricerca odontoiatrica si àe occupata dei possibili effetti estrogenici del BPA. Cià à stato dovuto all’aumento dell’utilizzo dei sigillanti e delle resine composite, in virtù sia del loro miglioramento intrinseco sia dell’avvento dei sistemi adesivi. Nella letteratura odontoiatrica internazionale sono comparsi articoli che sostengono o negano che il BPA e/o i suoi derivati possano essere rilasciati nel cavo orale da compositi o sigillanti in dosi tali da suscitare possibili effetti estrogenici. Olea et al. hanno individuato sia liberazione sia attività estrogenica in vitro di BPA e di BPAdimetacrilato da parte di un sigillante che era in grado di rilasciarne nella saliva dosi da 90 a 930 mg ogni 50 mg di composto. Con ricerche in vitro mediante High Performance Liquid Chromatography (HPLC), sia Hamid et al sia Nathanson et al. non hanno riscontrato, invece, presenza di BPA nell’eluato di numerosi sigillanti a uso dentale. Schafer et al. , utilizzando la citometria di flusso, hanno confermato la potenziale estrogenicità di BPA e BPA dimetacrilato, se presenti in dosi, perà, 1.000 volte superiori all’estrogeno di riferimento, rappresentato dal 17-b-estra-diolo. Nella prima rassegna della letteratura al riguardo, Soderholm et al.  affermavano che “le quantità di BPA che possono presentarsi come impurità o come prodotti di degradazione di compositi o sigillanti di uso dentale sono molto basse e ben lontane dalle dosi in grado di interessare il tratto riproduttivo”. Lewis et al. , in una ricerca in vitro, effettuata mediante HPLC per identificare rilascio di BPA e BPAdimetacrilato da 28 prodotti commerciali odontoiatrici (20 compositi e 8 sigillanti), non hanno riscontrato quantitaà misurabili di tali composti, con l’unica eccezione del Delton II, in grado di rilasciare quantitaà estrogeniche di bi-sfenoli in vitro. Schmalz et al. , in una sperimentazione in vitro, condotta mediante HPLC, sulla liberazione del BPA da sigillanti sottoposti a varie condizioni (pH variabili, azione di esterasi, immersione per 24 ore in saliva) sottolineano sia l’importanza della conversione del BPA dimetacrilato in BPA, sia il fatto che la maggior parte dei prodotti commerciali non presenta né l’uno ne l’altro dei composti. Arenholt-Bindslev et al. , mediante analisi con HPLC di campioni di saliva dopo sigillatura, hanno rilevato che “puà essere riscontrato BPA, ma tale presenza e notevolmente bassa e riscontrabile solo immediatamente dopo la posa del sigillante”. Pulgar et al. , mediante HPLC e gas-cromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), hanno individuato rilascio di BPA da 7 compositi commerciali in quantitàa tali da svolgere “effetti biologici”. Tarumi et al., provando con “reporter gene assay” la risposta endocrina a sigillanti e adesivi, individuano attività con due dei sigillanti, ma nessuna liberazione di BPA dai prodotti; gli autori concludono che “l’azione simil-endocrina à probabilmente legata al BPA dimetacrilato e la possibilita che il BPA eluato da resine dentali possa avere azioni mimanti gli steroidi à minima”. Fung et al. hanno effettuato una prova in vivo sulla saliva di 40 volontari dopo la posa di un sigillante, definendo la concentrazione di BPA mediante HPLC e riscontrando ridotte concentrazioni a 1 ora e a 3 ore (da 5,8 a 105,6 mg/L) nella saliva. Manabe et al., mediante estrazione selettiva in combinazione con GC-MS, hanno evidenziato che vari compositi e sigillanti rilasciavano BPA, ma in quantitàa 1.000 volte inferiori alla dose attiva estrogenica-mente in vivo. Atkinson et al. hanno investigato in vitro, con GC-MS e HPLC dopo immersione in saliva, la stabilità di BPA e BPA dimetacrilato puri, riscontrando che nella saliva libera il primo e stabile, mentre il secondo viene convertito in BPA con un processo la cui velocita e funzione di pH e temperatura. Darmani et al., studiando direttamente il BPA dimetacrilato somministrato per via intra-gastrica, hanno dimostrato notevoli effetti avversi su fertilità e riproduzione nei topi. Takahashi et al. hanno individuato rilascio di BPA anche da parte di corone in policarbonato. Sasaki et al. hanno investigato, in vivo, la concentrazione di BPA nella saliva di 21 volontari dopo restauri effettuati con 9 differenti compositi in commercio: utilizzando un sistema ELISA gli autori hanno riscontrato concentrazioni di BPA variabili da 15 a 100 ng/mL di saliva. Joskow et al. hanno effettuato uno studio in vivo sul rilascio di BPA da due sigillanti: dopo aver effettuato la sigillatura in 14 volontari, hanno riscontrato in tempi programmati (subito dopo, dopo 1 ora e dopo 24 ore) la quantita di BPA presente nella saliva e/o nelle urine, tramite GC-MS ad alta risoluzione. Nelle loro conclusioni gli autori affermano che “i sigillanti dentali possono essere fonte di ridotta esposizione al BPA, a livelli che manifestano effetti sulla salute dei topi. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se l’esposizione umana a questi livelli di BPA causi effetti avversi”. Eliades et al. non hanno riscontrato mediante HPCL il rilascio di BPA da due tipi di composito destinati al posizionamento di bracket ortodontici. Azarpazhooh et al.  concludono la loro rassegna della letteratura affermando che “i pazienti non sono a rischio di esposizione al BPA per l’uso di sigillanti dentali”; nonostante cià raccomandano che gli operatori dentali “per ridurre la potenziale tossicitàa dei sigillanti, provvedano ad applicare alcune semplici procedure cliniche”. Anche l’Association of American Dentists (ADA) presenta conclusioni rassicuranti: “Vi sono evidenze che alcuni sigillanti dentali e, in misura molto minore, compositi dentali possano contribuire a livelli molto bassi di esposizione al BPA. L’ADA appoggia pienamente ulteriori ricerche sull’innocuità del BPA ma, sulla scorta delle attuali conoscenze, ritiene che non vi siano le basi per identificare pericoli per la salute, relativamente all’esposizione al BPA, da parte di qualunque materiale dentale”. Partendo dalle suddette acquisizioni della letteratura, il presente lavoro ha avuto lo scopo di evidenziare e quantificare la presenza di BPA in campioni di saliva umana raccolti dopo 1 minuto dall’applicazione di un sigillante commerciale, mediante gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa. Gli autori dichiarano che lo studio presentato à stato realizzato in accordo con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki e che il consenso informato eà stato ottenuto da tutti i partecipanti prima del loro arruolamento allo studio

Materiali e metodi

Ottenuti il consenso informato dai singoli volontari e l’approvazione alla ricerca da parte del Comitato Etico dell’Universita degli Studi di Perugia, si è proceduto come segue: sono stati analizzati 30 campioni di saliva umana ottenuti da 15 volontari, di età compresa tra 21 e48anni (8 maschi e 7 femmine, eta media 30,5 anni). Di questi, 7 (4 maschi e 3 femmine) erano fumatori. I dati dei volontari sono riassunti nella tabella I. I singoli campioni erano costituiti da circa 4 mL di saliva, raccolti in tubi Falcon di polistirene da 16 mL. Dopo la raccolta, i campioni sono stati conservati a 4 °C sino al momento dell’analisi, effettuata entro 24 ore dal campionamento. Dei 30 campioni, 15 (numerati progressivamente da 1 a 15 con l’aggiunta della lettera A) costituivano i controlli (“bianchi”) essendo costituiti da saliva raccolta prima dell’applicazione del sigillante. La raccolta dei 15 campioni-test (numerati progressivamente da 1 a 15 con l’aggiunta della lettera B) à avvenuta invece dopo 1 minuto dall’applicazione e dalla polimerizzazione con lampada alogena (20 secondi) di 50 mg di sigillante Teethmate-F1 (Kuraray Europa, Frankfurt, Germany). L’applicazione à avvenuta, previo isolamento del campo, sempre sulla superficie vestibolare dell’elemento 4.3, senza condizionamento con mordenzante (per facilitare il successivo distacco del sigillante).

Preparazione del campione

Ogni campione di saliva eà stato equilibrato a temperatura ambiente (24 °C) e omogeneizzato mediante vortexatura per 5 minuti. Da ogni campione e stato poi prelevato 1 mL, cui sono stati addizionati 0,1 mLdi Internal Standard (IS), costituito da 3-idrossifeniletilalcol in etanolo (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany). La soluzione ottenuta àe stata poi lasciata a riposo per 30 minuti, in modo da permettere alla molecola di IS di interagire con la matrice.

2.2.    Separazione ed eluizione del bisfenolo A

Il campione à stato sottoposto a isolamento e purificazione con cromatografia a dispersione su matrice solida (MSPD), facendo uso di una colonnina di vetro (diametro 1 cm) provvista di setto in vetro, con grado di porosità G2, impaccata con 1,5 g di gel di silice, 70-230 mesh (Merck, Darmstadt, Germany), quale fase solida disperdente. Dato che la tecnica MSPD à funzione del pH e della forza ionica del campione, lo stesso prima della deposizione à stato addizionato di 0,4 g di NaCl e di 100 mL di HCl 1 M, e successivamente omogeneizzato. Dopo la percolazione del campione acquoso attraverso la fase stazionaria, si à proceduto all’eluizione del BPA e dell’IS prima con 6 mL di diclorometano e quindi con 5 mL di etilacetato. L’eluato ottenuto à stato raccolto in cono di concentrazione in vetro e portato a secco con flusso di azoto riscaldato (30 °C).

Derivatizzazione

Data la natura polare dell’analita (presenza di due gruppi ossidrilici), ai fini dell’analisi gascromatografica-spettro-scopica di massa eà stato necessario effettuare la derivatizzazione per silaniz-zazione del BPA come trimetilsilano (BPA-TMS) per aumentarne la volatilitàa: il residuo secco del campione àe stato, quindi, addizionato di 100 mL di una soluzione costituita da N,O-bis (trimetilsilil)-trifluoroacetamide (BSTFA) all’1% in trimetilclorosilano (TMCS) (Superchrom, Milano) e 100 mL di piridina. Il tutto e stato lasciato reagire a 24 °C per 40 minuti. Si à, quindi, proceduto all’analisi GC-MS di 1 mL della soluzione ottenuta.

Analisi strumentale

L’identificazione del BPA e avvenuta per confronto tra i tempi di ritenzione del BPA nei singoli 30 campioni, comparati con quello di eluizione di una soluzione standard di BPA sottoposta alle stesse condizioni, nonché per confronto diretto dello spettro di massa evidenziato sperimentalmente per l’analita con quelli riportati nelle banche dati NIST92 e Wiley5. La caratterizzazione gascromatografica-spettrometrica di massa eà stata condotta utilizzando una colonna capillare CP-Sil8-MS da 30 m, con diametro interno di 0,25 mm e con film di fase stazionaria dello spessore di 0,25 mm; essa e stata programmata termicamente a 120 °C per 3 minuti, da 120 °C a 292 °C, con incremento della temperatura di 10 °C/min, da 292 °C a 300 °C, con incremento di 30 °C/min e, infine, a 300 °C per 20 minuti. Eà stato utilizzato un iniettore Split (1:2) a 280 °C.  E stato impiegato un gascromatografo Varian CP-3800 (Varian, Palo Alto, USA) interfacciato con uno spettrometro di massa a trappola ionica Varian 2000 impostato come segue: transfer line 250 °C; manifold 150 °Ce trappola ionica 200 °C; voltaggio elettromoltiplicatore 1.700 V; acquisizione in full scan (range di massa 100-450 m/z) a 1 secondo/ scan. La ionizzazione delle molecole àe stata condotta per impatto elettronico a 70 electronvolt, con acquisizione di ioni positivi, e la quantificazione del BPA àe stata effettuata sugli ioni caratteristici del derivato TMS, ossia sugli ioni m/z 357 e 372.

Analisi quantitativa e rette di calibrazione

Le soluzioni standard di BPA e IS sono state ottenute per solubilizzazione di 5 mg di ognuno in un matraccio da 100 mL con etanolo al 100%. Per la quantificazione del BPA e stata costruita una retta di calibrazione su quattro punti a diversa concentrazione (2,074 mg/mL; 1,037 mg/mL; 0,518 mg/mL; 0,259 mg/ mL) con l’aggiunta sempre della stessa aliquota di 100 mL di soluzione dell’IS. La retta eà stata ottenuta riportando:

  •    sulle ascisse il rapporto tra area del BPA e area dell’IS impiegato;
  •    sulle ordinate la corrispondente concentrazione (espressa in mg/mL).

Dall’equazione di tale retta e stato quindi possibile estrapolare i valori incogniti di concentrazione relativi all’analita di interesse.

Risultati e discussione

Dal punto di vista qualitativo, tutti i soggetti volontari esaminati hanno presentato un profilo GC-MS della saliva comparabile: tutti i campioni, compresi i 15 bianchi, hanno manifestato la presenza di BPA, confermando la sua natura ubiquitaria. Le concentrazioni evidenziate nei bianchi, comunque, sono state tali (valore medio sempre < 0,5 ng/mL) da non interferire con una corretta valutazione quantitativa del BPA. Dal punto di vista quantitativo, i risultati ottenuti nei 15 campioni-test sono riportati nella tabella II e sintetizzati graficamente nella fig. 1. Il valore medio di BPA rilasciato nella saliva dopo un minuto dall’applicazione del sigillante e stato di 54,3 ± 74 ng/mL. L’elevata deviazione standard è legata all’ampio range dei dati analitici, che vanno da un minimo di 7,1 ng/mL (soggetto 15B) a un massimo di 262,2 ng/mL (soggetto 3B). I valori di BPA riscontrati appaiono in linea con quelli presenti in letteratura e risultano, comunque, sempre inferiori a quelli necessari a indurre attivitaè simil-estrogenica in vivo. Al fine di un’analisi piè dettagliata, sono stati calcolati i valori medi e le relative deviazioni standard delle concentrazioni di BPA in:

  •    soggetti di sesso maschile (valore medio 15,1 ± 5,4 ng/mL);
  •    soggetti di sesso femminile (valore medio 99,1 ± 99,4 ng/mL);
  •    soggetti fumatori (valore medio 25,9 ± 29,9 ng/mL);
  •    soggetti non fumatori (valore medio 79,1 ± 93,2 ng/mL).

Tali valori sono stati comparati con il valore medio dei 15 campioni-test (fig. 2). I valori medi di BPA piè alti sono a carico dei soggetti di sesso femminile e dei soggetti non fumatori; a quest’ultimo riguardo si puè ipotizzare che le basse concentrazioni rilevate nei soggetti fumatori possano essere associate alla presenza nella saliva di particelle derivanti dal fumo di sigaretta, quali materiali carboniosi e/o cinerei, in grado di adsorbire parte del BPA. Abbiamo poi tentato di correlare la forte variabilita dei dati analitici con i valori di pH relativi ai campioni analizzati (compresi in un intervallo da 6,5 a 8,5): applicando il t di Student si è evidenziato che i valori di pH e le concentrazioni di BPA presentano una correlazione inversa statisticamente significativa (p < 0,05). Applicando lo stesso test alla correlazione tra concentrazioni di BPA ed etèa dei soggetti, non eè stata invece rilevata alcuna significativitaè statistica (p = 0,2491)

Conclusioni

I 15 campioni di saliva raccolti nei volontari dopo 1 minuto dall’applicazione del sigillante commerciale testato presentano concentrazioni medie di BPA pari a 54,3 ± 74 ng/mL, comparabili con i dati della letteratura e inferiori a quelle necessarie a esplicare attivitèa simil-estrogenica in vivo. Il BPA è presente in tracce anche nei campioni di controllo, e ciè ne sottolinea la natura ubiquitaria. Il sesso maschile e l’abitudine al fumo appaiono correlati a minori concentrazioni di BPA. Eè stata evidenziata una correlazione inversa statisticamente significativa tra i valori di pH e le concentrazioni di BPA. Non è stata evidenziata correlazione statisticamente significativa tra etèa dei soggetti e concentrazioni di BPA.

 

 

 

 

 

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