L’IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA COME AUSILIO DIAGNOSTICO PER LE PATOLOGIE DEL CAVO ORALE

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Fig. 1a-c Manifestazioni orali di una patologia immunomediata: si evidenziano ulcerazioni a livello della gengiva mascellare e mandibolare. Si può osservare una bolla intatta in zona 15. A livello del palato molle sono presenti due erosioni simmetriche. Il paziente risulterà essere affetto da pemfigoide delle membrane mucose.
Fig. 1a-c Manifestazioni orali di una patologia immunomediata: si evidenziano ulcerazioni a livello della gengiva mascellare e mandibolare. Si può osservare una bolla intatta in zona 15. A livello del palato molle sono presenti due erosioni simmetriche. Il paziente risulterà essere affetto da pemfigoide delle membrane mucose.
Fig. 1a-c Manifestazioni orali di una patologia immunomediata: si evidenziano ulcerazioni a livello della gengiva mascellare e mandibolare. Si può osservare una bolla intatta in zona 15. A livello del palato molle sono presenti due erosioni simmetriche. Il paziente risulterà essere affetto da pemfigoide delle membrane mucose.
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD
Fig. 2a-g Utilizzo del bisturi carotatore per eseguire due prelievi in una paziente affetta da sospetta patologia ulcerativa immunomediata: il primo prelievo perilesionale ai margini dell’ulcerazione verrà processato per l’istologia convenzionale, mentre il prelievo a livello della mucosa sana servirà per effettuare l’IFD

  

Fig. 3 Depositi di immunocomplessi a livello della sostanza intercellulare epiteliale in un caso di pemfigo volgare
Fig. 4 Depositi lineari di immunocomplessi a livello della membrana basale in un caso di pemfigoide delle membrane mucose
Fig. 5 Quadro di IFD in un paziente affetto da lichen planus orale: depositi irregolari di fibrinogeno lungo la membrana basale con aspetto shaggy e corpi citoidi IgG-positivi

  INTRODUZIONE

L’immunofluorescenza diretta (IFD) è una tecnica di laboratorio che permette l’identificazione di anticorpi e altre proteine infiammatorie all’interno di un tessuto, con l’obiettivo di supportare il processo diagnostico in numerose patologie immunomediate per le quali gli aspetti clinici e istopatologici non risultano sufficienti per una diagnosi di certezza. La tecnica è stata descritta per la prima volta nel 1941 da Coons et al., mentre il suo impiego in patologia orale e maxillofacciale risale a poco più di quarant’anni fa. L’IFD prevede l’utilizzo di anticorpi coniugati con fluorocromi che vengono fatti reagire con sezioni non fissate di tessuto al fine di evidenziare la presenza e la localizzazione di antigeni specifici per l’anticorpo utilizzato. I fluorocromi sono molecole che hanno la capacità di assorbire luce con una determinata lunghezza d’onda e di emetterne di un’altra permettendo la visualizzazione in situ del legame fra anticorpo coniugato e il suo specifico antigene. Gli anticorpi tipicamente utilizzati per l’IFD sono fluoresceinaconiugati e riconoscono i seguenti antigeni: immunoglobuline umane G (IgG), immunoglobuline umane M (IgM), immunoglobuline umane A (IgA), fattore C3 del complemento e fibrinogeno. L’obiettivo di questo articolo è descrivere i punti chiave della tecnica di IFD nel processo diagnostico di numerose patologie immunomediate del cavo orale.

MATERIALI E METODI

Per la stesura del presente articolo è stata effettuata una revisione critica della letteratura disponibile sull’IFD applicata al cavo orale al fine di approfondire i vari passaggi della tecnica, partendo dalle indicazioni fino all’interpretazione dei risultati. Una prima selezione degli articoli presi in esame in questa revisione è stata compiuta interrogando il database MedLine con le seguenti parole chiave: “direct immunofluorescence” AND (“autoimmune blistering diseases” OR “immunomediated disorders” OR “mucous membrane pemphigoid” OR “pemphigus” OR “oral lichen planus” OR “lupus erythematous”). Gli articoli sono poi stati selezionati manualmente includendo gli studi che trattavano il test di IFD svolto a livello del cavo orale. Sono stati esclusi gli studi relativi al test di IFD a livello esclusivamente cutaneo. Le bibliografie degli articoli selezionati sono state esaminate per l’inclusione di ulteriori articoli rilevanti.

RISULTATI

INDICAZIONI

L’IFD è indicata ogni qual volta si sospetti la diagnosi di patologia immunomediata a carico della mucosa del cavo orale. Questi disordini possono avere manifestazioni cliniche sovrapponibili caratterizzate da ulcerazioni, erosioni, presenza di vescicole o bolle e quadri di gengivite desquamativa che persistono per alcune settimane (fig. 1ac). Oltre alla bocca possono essere coinvolte mucose extraorali e la cute. L’istologia tradizionale spesso non è sufficiente per distinguere le diverse patologie e si rende pertanto necessaria l’IFD. L’IFD è utilizzata per confermare o escludere una delle seguenti malattie: pemfigo volgare, pemfigo paraneoplastico, pemfigoide delle membrane mucose, dermatosi a IgA lineare, epidermolisi bollosa acquisita, stomatite ulcerativa cronica, lupus eritematoso. Talvolta l’esame può risultare utile anche nel processo diagnostico di pazienti affetti da lichen planus orale. Infatti, sebbene nella maggior parte dei casi le manifestazioni cliniche e l’istologia convenzionale siano sufficienti per porre una diagnosi, in alcune forme erosive o quando la patologia si manifesta con un quadro clinico di gengivite desquamativa l’IFD viene richiesta per differenziare questa condizione da altre patologie vescicoloerosive.

SCELTA DEL SITO DEL PRELIEVO

La scelta del sito più idoneo per effettuare il prelievo per l’esame di IFD è un aspetto cruciale per il successo della tecnica. Tutti gli autori sono concordi nel ritenere inadeguate come sito di prelievo aree di ulcerazione in quanto al laboratorio deve pervenire un tessuto che presenti intatta la giunzione epitelioconnettivale. Anche aree di severa infiammazione dovrebbero essere evitate in quanto i processi infiammatori sono in grado di degradare gli immunocomplessi rendendoli non evidenziabili. Per le malattie vescicolobollose la maggior parte degli autori è concorde nel ritenere la zona perilesionale come sito più idoneo per effettuare il prelievo per l’IFD. In particolare, per area perilesionale s’intende una zona della mucosa distante 0,21 cm dalla lesione che si sospetta essere manifestazione della patologia immunomediata. Alcuni autori specificano che il tessuto del prelievo dovrebbe essere clinicamente normale e intatto. Secondo i dati riportati in uno studio, non sembra che vi siano differenze statisticamente significative in termini di positività al test di IFD (detection rate) fra i prelievi perilesionali e quelli effettuati a distanza > 1 cm. Se questo dato venisse confermato da altri studi l’operatore potrebbe disporre di una scelta più ampia per il sito di prelievo e ciò risulterebbe particolarmente utile soprattutto quando effettuare biopsie perilesionali risulta tecnicamente indaginoso. A differenza delle patologie vescicolobollose, per le patologie immunomediate con componente ipercheratosica (lichen planus, lupus eritematoso) il sito più idoneo per eseguire il prelievo da sottoporre all’IFD dovrebbe includere l’area ipercheratosica e anche la mucosa eritematosa adiacente. Non vi è un distretto anatomico in assoluto “migliore” per effettuare il prelievo. Per motivi di accesso e di facilità tecnica Siegel suggerisce, quando possibile, la mucosa labiale o geniena. Sano et al. non hanno riscontrato differenze statisticamente significative in termini di detection rate fra i prelievi effettuati in diversi distretti anatomici: in questo studio la mucosa gengivale risultava essere la zona con il minor detection rate (30%). Se le lesioni coinvolgono altri distretti oltre quello gengivale, alcuni studi suggeriscono di non praticare il prelievo dalla gengiva in quanto è tecnicamente difficile ottenere tessuto adeguato: dall’intervento può infatti derivare un difetto parodontale permanente e in alcuni casi l’infiammazione placcacorrelata può inficiare la lettura dei campioni. Nel caso del pemfigoide delle membrane mucose (PMM), se la malattia coinvolge anche la cute è preferibile ottenere il prelievo da cute perilesionale. Alcuni autori suggeriscono il prelievo intraorale, anche in assenza di lesioni, se l’unico distretto coinvolto è quello oculare: la biopsia congiuntivale infatti non è scevra di rischi e nel PMM può scatenare un processo cicatriziale difficilmente controllabile. L’assenza di lesioni cliniche non implica la negatività all’IFD: secondo alcuni dati preliminari riportati in un articolo di Grau et al. l’IFD effettuata su mucosa orale clinicamente sana risulta diagnostica nel 60% dei casi di PMM puramente oculare.

TECNICA DI PRELIEVO

La fase chirurgica si pone l’obiettivo di prelevare una quota adeguata di tessuto evitando che la porzione superficiale epiteliale, tipicamente molto fragile, venga persa durante le manovre. Come obiettivo secondario, inoltre, occorre minimizzare il discomfort postoperatorio. In letteratura non vi è un consenso univoco a favore di una determinata tecnica e spesso la scelta dell’operatore si basa sulla personale preferenza ed esperienza. Indipendentemente dalla tecnica scelta, la biopsia va effettuata dopo aver sospeso per almeno un mese eventuali terapie topiche con cortisonici, in modo da ridurre il rischio di ottenere risultati falsi negativi. In generale è consigliabile evitare l’infiltrazione dell’anestetico direttamente nel sito del prelievo perché può causare, come artefatto, il distacco epitelioconnettivale. Qualora non vi siano controindicazioni, si consiglia l’utilizzo del vasocostrittore per assicurare migliore visibilità all’operatore e maggior comfort al paziente. Il primo autore a suggerire in modo dettagliato una specifica tecnica bioptica per l’IFD fu Siegel nel 1991. Secondo l’autore, prima di effettuare il prelievo occorre strofinare delicatamente la mucosa con uno strumento smusso per evocare il segno di Nikolsky (distacco degli strati superficiali della mucosa in seguito all’applicazione di forze tangenziali) in un’area distante almeno 5 mm dalla lesione, in modo da favorire l’eventuale formazione di una bolla. Nell’area strofinata si effettua un’incisione a cuneo con il bisturi a lama fredda, profonda almeno 34 mm, per includere parte del connettivo. Il tessuto viene poi rimosso con l’ausilio di pinzette atraumatiche. Risulta fondamentale maneggiare con estrema cura il campione per evitare di indurre danni o artefatti che renderebbero inadeguato il materiale prelevato e per evitare la perdita dell’epitelio. Il cuneo di tessuto prelevato viene poi diviso a metà per ottenere due campioni speculari da inviare all’analisi microscopica standard e di IFD. Sebbene la tecnica di Siegel sia spesso citata in molti articoli, non vi sono studi che dimostrino la validità della procedura o la superiorità rispetto ad altre modalità di prelievo; inoltre alcuni studi sconsigliano chiaramente di dividere a metà il pezzo bioptico e suggeriscono invece di effettuare due prelievi distinti. Per quanto riguarda i prelievi gengivali, che in genere si eseguono quando l’unico sito coinvolto è appunto la gengiva, è stata proposta recentemente una tecnica specifica, denominata “stabandroll” (penetra e ruota). Gli autori suggeriscono di evitare con la lama da bisturi forze di tipo trasversale per ridurre il rischio di dislocazione dell’epitelio. Propongono pertanto di penetrare delicatamente con la lama nella gengiva fino a raggiungere la superficie ossea; a questo punto, invece di incidere il tessuto esercitando una trazione lineare con la lama, consigliano di ruotarla verso il tessuto facendo perno sulla punta. In tal modo si ottengono solo forze dirette internamente e non lateralmente. Applicando questa tecnica gli autori riferiscono il mantenimento dell’epitelio nel 98,1% dei casi. Non vi è accordo in letteratura circa la superiorità del bisturi carotatore (punch) rispetto alla lama tradizionale nelle  biopsie per IFD. Nello studio già citato di Sano et al. si riporta che le biopsie effettuate con il punch hanno un detection rate significativamente più elevato rispetto a quelle con lama tradizionale. Endo et al.  consigliano, se si impiega il punch, di non effettuare il consueto movimento rotazionale ma di applicare esclusivamente una pressione contro il tessuto per ridurre il rischio che forze laterali possano dislocare l’epitelio. Sono consigliati bisturi carotatori con diametro di almeno 4 mm. Un esempio di biopsia con punch è riportato in figura 2a-g.Poiché i prelievi per l’IFD sono in genere sottili e fragili, al cuni autori consigliano di posizionarli rivolti con il connettivo verso il basso su un ritaglio di carta bibula per 1 minuto prima di immergerli nel liquido di trasporto. Ciò consente di mantenerli piani durante le manipolazioni successive e facilita la scelta della corretta direzione di taglio.

CONSERVAZIONE, SPEDIZIONE E PROCESSAZIONE DEI CAMPIONI

Prima della commercializzazione di un idoneo liquido di trasporto, i prelievi per IFD venivano inviati al laboratorio entro 15 minuti allo stato “fresco” avvolti in garze inumidite con soluzione fisiologica, oppure congelati in azoto liquido direttamente nella struttura ove era stato effettuato il prelievo e spediti al laboratorio mantenendoli congelati. L’impossibilità per alcune strutture di accedere immediatamente al laboratorio e i costi legati al trasporto di materiale congelato hanno spinto i ricercatori a elaborare sistemi alternativi che rendessero più maneggevole il passaggio alle fasi di processazione in laboratorio. A differenza dei prelievi per la microscopia convenzionale, non è possibile utilizzare la formalina poiché il fissaggio causa modificazioni strutturali alle proteine, incluse quelle ricercate con l’IFD, riducendone la disponibilità nei siti di legame alle immunoglobuline coniugate. Il materiale comunemente usato per trasportare i prelievi al laboratorio è il liquido o soluzione di Michel, dal nome del suo ideatore, il dermatologo Beno Michel. Nel 1972 Michel et al.  pubblicarono un articolo che per la prima volta descriveva la possibilità di impiegare una soluzione contenente solfato d’ammonio, Netilmaleimide, citrato di potassio, solfato di magnesio e acqua distillata per il trasporto al laboratorio dei prelievi bioptici da sottoporre a IFD. Questa miscela permette di mantenere l’antigenicità del tessuto per molti giorni ma, non essendo un fissativo, non è in grado di bloccare i processi proteolitici che iniziano già dopo poche ore. Per questo, al fine di massimizzare il mantenimento morfologico del tessuto, è consigliabile spedire prontamente il campione al laboratorio dove verrà adeguatamente trattato, congelato e stoccato prima di essere sezionato e fatto reagire con gli anticorpi coniugati.

INTERPRETAZIONE

La valutazione del risultato dell’IFD viene effettuata dal patologo per mezzo di un microscopio a fluorescenza. Nel referto che ne deriva verrà riportata la presenza o  assenza di immunodepositi. Se presenti si forniranno anche informazioni sul tipo di immunodepositi (IgG, IgA, IgM, C3, fibrinogeno), sull’intensità relativa (forte, debole), sulla localizzazione (sostanza intercellulare, nuclei cellulari, membrana basale), sulla morfologia (lineare, granulare, “shaggy” ecc.). Rispetto alla diagnosi suggerita dal clinico, i risultati potranno essere coerenti, suggestivi o non indicativi. Il patologo riporterà se il risultato è indicativo per una patologia diversa da quella suggerita. Nelle note verranno descritti eventuali problemi tecnici, inclusa l’assenza di epitelio, o la necessità di effettuare ulteriori indagini, per esempio sierologiche, per completare il processo diagnostico. I quadri di immunofluorescenza per le principali patologie immunomediate che possono coinvolgere il cavo orale sono riportati nella tabella I [6,8,9,15-19]  (figg. 3-5). Rinaggio et al., in uno studio che descrive i risultati di 270 prelievi bioptici da mucosa orale indagati con l’IFD per sospette patologie vescicolobollose, riportarono che nel 52% dei casi non si era evidenziata la presenza di immunoreattanti. In alcuni di questi casi, in base agli aspetti istopatologici, veniva posta una diagnosi conclusiva di patologia non vescicolobollosa (inclusi 2 casi di carcinomi a cellule squamose e 6 di displasia epiteliale). In altri 14 casi i campioni erano considerati inadeguati per la mancanza dell’epitelio. I casi restanti negativi all’IFD erano costituiti da lesioni aspecifiche ulcerative, vescicolobollose e/o infiammatorie. Gli autori non riportano quanti di tali casi fossero in realtà falsi negativi. Il problema dei falsi negativi viene solo marginalmente affrontato in letteratura. Eseguire in modo scrupoloso tutti i passaggi della tecnica permette di aumentare il detection rate, tuttavia esistono sottogruppi di pazienti con manifestazioni cliniche tipiche di una patologia vescicolobollosa immunomediata in cui non è possibile dimostrare la presenza di immunodepositi. Alcuni di questi casi sono riconducibili a forme farmacocorrelate, ma ulteriori studi sono necessari per stabilire i criteri diagnostici di questo gruppo di pazienti. Talvolta sono necessarie biopsie multiple per evidenziare gli immunodepositi. Qualora l’IFD risultasse negativa e gli aspetti clinici e istopatologici fossero insufficienti, è possibile avvalersi di diverse tecniche per la ricerca degli anticorpi a livello sierico (fig. 6). Tra queste la più utilizzata è l’immunofluorescenza indiretta. Per questo esame si usano sezioni di tessuto simile alla mucosa orale (per esempio esofago di scimmia, vescica di topo o cute umana) che vengono incubate con il siero prelevato dal paziente. Se sono presenti autoanticorpi diretti contro strutture epitelioconnettivali della mucosa orale, questi si legano con le omologhe strutture del substrato utilizzato e possono essere individuati impiegando anticorpi antiimmunoglobuline umane fluoresceinaconiugati. Recentemente sono stati commercializzati anche kit ELISA che si avvalgono di antigeni ricombinanti per la ricerca di autoanticorpi circolanti. Questi kit presentano un’elevata specificità diagnostica e una sensibilità paragonabile a quella dell’immunofluorescenza indiretta, ma rispetto a quest’ultima sono automatizzabili e quantitativi. Tuttavia, a causa della loro specificità antigenica, sono piuttosto restrittivi e possono evidenziare solo gli autoanticorpi per gli antigeni ricombinanti utilizzati. Oltre che per il supporto diagnostico, questi kit servono anche nella fase di monitoraggio della malattia. In particolare nei pazienti affetti da pemfigo i valori ricavati con l’ELISA degli anticorpi antidesmogleina 1 e 3 correlano con l’estensione e l’attività della malattia, mentre la persistenza di alti valori di anticorpi antidesmogleina 1 rappresenta un fattore predittivo positivo per recidive cutanee. In alcuni centri un test ELISA negativo costituisce un prerequisito per l’interruzione del trattamento.

DISCUSSIONE

Le patologie immunomediate che si manifestano a livello del cavo orale rappresentano una problematica significativa per le persone che ne sono affette e per i clinici che sono chiamati a gestirne la diagnosi e successivamente la terapia. Tipicamente queste patologie hanno un’insorgenza acuta o subacuta e si manifestano con la presenza di erosioni, ulcerazioni o bolle e con periodi di parziale remissione delle lesioni. Nelle fasi di acuzie i disagi riferiti dai pazienti possono essere molto intensi e tali da compromettere le normali funzioni del cavo orale, influenzando negativamente la qualità di vita. Una diagnosi corretta e tempestiva costituisce la condizione necessaria per impostare una terapia validata ed efficace e per gestire adeguatamente le possibili sequele che, come nel caso del pemfigo volgare e del PMM, possono mettere a rischio la vita stessa del paziente. L’identificazione di tali patologie non è semplice in quanto gli aspetti clinici e istopatologici non sono in genere sufficienti per porre diagnosi. Ciò spiega il numero di mesi, spesso elevato, che intercorre fra la prima visita e la diagnosi definitiva. Frequentemente i pazienti, in questo lasso di tempo, si rivolgono a diversi specialisti sottoponendosi a biopsie ripetute, numerosi esami di laboratorio e terapie aspecifiche non sempre efficaci. Per ridurre tali inconvenienti è importante conoscere gli ausili diagnostici attualmente disponibili e saperli utilizzare. Fra questi, l’IFD rappresenta un esame cardine nel processo diagnostico delle malattie immunomediate del cavo orale. Per ottenere materiale adeguato per gli studi di immunofluorescenza occorre individuare un sito adatto dove eseguire la biopsia, prelevare un frammento mucoso intatto che mantenga tutto l’epitelio con parte del connettivo e spedire il materiale al laboratorio in modo corretto per la successiva processazione e lettura. Un errore in uno di tali passaggi può compromettere l’esito dell’esame. All’operatore che si avvicina per la prima volta all’utilizzo di questo test diagnostico si richiedono le conoscenze di base riassunte nel presente articolo e, ove possibile, un periodo di training al fianco di operatori esperti. Risulta inoltre fondamentale la possibilità di interagire direttamente con il patologo per risolvere rapidamente eventuali problemi riscontrati nelle varie fasi del test di IFD, per discutere dei casi dubbi e definire insieme le azioni da intraprendere.

CONCLUSIONI

Ottenere una diagnosi precisa è fondamentale per la gestione di ogni malattia delle mucose orali. L’IFD rappresenta un esame fondamentale nell’iter diagnostico delle patologie immunomediate e richiede un’adeguata preparazione da parte dei diversi operatori (medici, altro personale sanitario e tecnici di laboratorio) che sono coinvolti dal momento del prelievo bioptico fino alla consegna del risultato.

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